蛋白质免疫印迹技术在大学生创新实验中的应用

　　蛋白质印迹法(蛋白免疫印迹)即Western Blot，[1-2]是在 DNA 印迹法(Southern blot)和 RNA 印迹法(Northern blot) 之后，整合电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白分离检测技 术，是对电泳技术的进一步延深和发展。目前是一种应用 比较广泛的蛋白质检测实验方法，主要应用于免疫遗传学、 生物化学和分子生物学中，同时也广泛应用于蛋白水平的 表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个领域。[3]其 基本原理主要是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的细胞或 组织蛋白，用电印免疫印迹法转移到固相支持物(化学惰性 的高分子转移膜，如聚偏二氟乙烯膜)上，然后将目标蛋白 的特异性抗体(一抗)与转移膜上的目标蛋白进行免疫结合 反应，再用被辣根过氧化物酶标记过的二抗与一抗结合，随 后通过分析着色的位置和着色深度来检测目标蛋白。 进行蛋白质免疫检测通常需经过蛋白裂解及变性、蛋 白电泳分离、转模、封闭、一抗孵育、二抗孵育和特异性检测 等环节，由于该试验涉及的步骤较多，对实验设备及操作人 员的要求较高，目前还未针对本科生开设此类课程。本文 以贵州大学面向本科生开设的大学生开放性实验课为基 础，对该实验在本科实验教学中进行应用，教学效果良好。

　　1 课程内容设计 该课程为大学生创新性实验计划课程，是农业及生命 科学学科的选修课程。整个实验课程内容为一个小设计型 实验项目。本课程的主要内容包括掌握蛋白质印迹法的原 理、目标蛋白载体的构建、蛋白质可溶性表达、PAGE 胶制 作，以及 Western blot 实验。 本课程通过设定不同条件(如温度、菌株及不同IPTG，异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl -D-Thiogalactoside，浓 度)，以实现对目标蛋白的可溶性表达。由于本课程需进行 连续性实验，课程均安排于周末进行，共分为 5 次实验及 1 次汇报，每次实验时间约 2~8 学时，共约 20~28 学时。具体 课程内容和安排见表 1。

　　2 代表性结果 以在实验教学过程中 1 组同学选择的高粱(Sorghum bicolor)的抗病蛋白 STG1 为例。同学们对 STG1 进行了基 因扩增、生物信息学分析、载体 pET28a 载体构建、原核表 达条件摸索以及 Western blot 检测，最终用 Anti His 抗体在 重组菌株的上清样品中检测到一条清晰单一条带，而空载 体对照都没有相应条带，说明 STG1 蛋白成功表达。

　　3 教学效果

　　3.1 增强学生对蛋白免疫印迹技术及相关生化实验技 术的理解在本次大学生创新实验教学中，首先让学生利用在线 网站和文献检索了解相关实验技术，了解其原理和实验操 作步骤。其次，学生要通过自主设计实验并验证蛋白是否 成功表达，前提就要求学生要对基因、蛋白有一定的了解。 学生通过亲自参与整个实验设计与操作，更进一步地增强 了对蛋白免疫印迹技术及相关生化实验技术的理解和掌握。 3.2 锻炼学生的动手和分析能力 在实验操作中，蛋白免疫印迹技术有两大关键因素：(1) 必须将分离的蛋白很好地从PAGE凝胶上转到固相支持物 上。在此过程中，对转膜缓冲液的选择显得尤为重要，它对 蛋白与膜和探针的结合起着决定性作用。(2)对抗体的选 择，抗体是目前在该技术中最常用的标记探针。在实验验 证环节，许多学生会出现没有得到理想的预期结果(信号弱 或无信号、条带大小与预期不符、非特异条带、背景高、污点 等常见问题)，这是可能由于在转膜过程中所配缓冲液组分 不对，抗体选择不对(一抗、二抗选择及浓度选择)，在转膜 时温度过高，制作PAGE凝胶时胶上有气泡、胶厚度不一致、 凝固程度不一致等因素造成的。这些都需要学生在操作过 程中认真思考、按要求操作、多次摸索、总结经验、找出失败 原因，多与老师和同学进行讨论问题才能最终找到解决方 案。问题能得到有效的解决，是鼓励学生进行下一步实验 的关键。对于在本实验中出现的问题，说明学生的动手操 作能力还不够，在本科阶段很有必要设立此类动手能力强 的生化实验类创新课程，提高本科生的实际动手操作能力。

　　3.3 实验教学的推广性分析 蛋白免疫印迹技术在分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中是一种非常实用的实验技术。对于只了解其理论知 识而未受到过实际操作培训的同学，具有实际的意义。对 于农业及生命科学学科类专业的同学，学校具备实施此类 实验技术的相关设备，更应开设其相关实验课程。此外，该 实验的最大优势就在于其适应性好，不需要特殊的实验仪 器。因此，希望通过蛋白免疫印迹技术的推广，能让广大本 科生受益。

　　4 教学总结 对 2019 年度的教学总结发现，40%的实验组通过自主 学习下完成实验，约 55%的实验组能在老师的指导下完成 实验，5%的实验组不能顺利完成实验。教学实践结果显示 该实验适合于高年级本科生(大三、大四)，最好有分子生物 学以及基本的生物信息学基础的同学。学生在课程结束时 要 PPT 汇报，并写一份实验报告以及个人学习总结，以锻 炼他们的书面和口头表达能力。从汇报和实验报告来看， 学生对实验背景、材料与方法、实验操作过程和各阶段的实 验结果都有清晰的认识。因此，非常有必要在本科教学中 推广此类课程。 *通讯作者：谢鑫 基金项目：贵州省科技计划(黔科合支撑[2019]2408号)

　　参考文献

　　[1] Xu J, Bai L, Gu YY, Du F, Liu YJ. Synthesis, characterization, ap- optosis, ROS, autophagy and western blotting studies of cyclometa- lated iridium(iii) complexes[J]. Inorganic Chemistry Communica- tions,2019,111:107594.

　　[2] Moritz CP. 40 years Western blotting: A scientific birthday toast[J]. Journal of Proteomics, 2020,212.

　　[3] 宋亮,陈丹丹.浅谈蛋白质印迹法操作过程中的实验技巧[J].科技 资讯,2015,13(21):63-65.